มารู้จักเทคนิค Real-time PCR กันเถอะ

Real-time PCR ถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในงานด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล การแพทย์ การวินิจฉัยโรคติดเชื้อ งานวิจัยด้านจีโนมิกส์ รวมถึงการตรวจวัดระดับการแสดงออกของยีน (gene expression analysis)

เทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์ (Real-time Polymerase Chain Reaction; Real-time PCR) หรือที่เรียกว่า quantitative PCR (qPCR) เป็นเทคนิคทางอณูชีววิทยาที่ใช้สำหรับการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเป้าหมายอย่างจำเพาะ พร้อมทั้งสามารถตรวจวัดปริมาณของดีเอ็นเอที่ถูกสังเคราะห์ขึ้นได้ในทุก ๆ รอบของการเพิ่มจำนวนในขณะที่ปฏิกิริยากำลังดำเนินอยู่แบบเรียลไทม์ เทคนิคนี้พัฒนาต่อยอดจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม ซึ่งสามารถตรวจสอบผลลัพธ์ได้เฉพาะหลังสิ้นสุดปฏิกิริยาเท่านั้น โดย Real-time PCR อาศัยการใช้ไพรเมอร์ (primer) จำนวน 1 คู่ ร่วมกับตัวตรวจจับสัญญาณ (probe) ซึ่งถูกออกแบบให้เป็นสายโอลิโกนิวคลีโอไทด์สั้นที่มีความจำเพาะต่อดีเอ็นเอเป้าหมาย และมีการติดฉลากสารเรืองแสง (fluorescent label) เมื่อเกิดการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ สัญญาณเรืองแสงจะถูกปล่อยออกมาและถูกตรวจวัดในแต่ละรอบของปฏิกิริยา โดยความเข้มของสัญญาณดังกล่าวมีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้น ทำให้สามารถวิเคราะห์เชิงปริมาณได้อย่างแม่นยำ

     โดยทั่วไปดีเอ็นเอที่เพิ่มจากการทำปฏิกิริยา PCR จะเพิ่มเป็นลักษณะกราฟรูปตัว S (sigmoid หรือ exponential curve) โดยแกน Y แสดงสัญญาณการเรืองแสง และแกน X แสดงจำนวนรอบของการเพิ่มจำนวน การทำ real-time PCR เพื่อที่จะให้ได้ข้อมูลที่ถูกต้องแม่นยำ การตรวจวัดผลผลิต PCR ในเวลาที่เกิดขึ้นจะทำเฉพาะในช่วง exponential phase ซึ่งเป็นช่วงที่ระดับสัญญาณสารเรืองแสงสูงเหนือระดับ threshold และมีแนวโน้มการเพิ่มจำนวนแบบทวีคูณ (exponential) เท่านั้น

ภาพ 1 กราฟการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอด้วยเทคนิค real-time PCR
แกน X แสดงจำนวนรอบของการเพิ่มจำนวน (cycle number)
แกน Y แสดงความเข้มของสัญญาณเรืองแสง (fluorescence intensity)

รูปแบบการตรวจวัดสัญญาณใน Real-time PCR

การตรวจวัดปริมาณดีเอ็นเอในเทคนิค Real-time PCR สามารถแบ่งออกเป็น 2 รูปแบบหลัก ดังนี้

DNA-binding fluorescent dyes
เป็นการใช้สารเรืองแสงที่สามารถจับกับดีเอ็นเอสายคู่ (double-stranded DNA) ที่เกิดขึ้นใหม่ ตัวอย่างที่นิยมใช้มากที่สุดคือ SYBR Green I เมื่อสารดังกล่าวจับกับดีเอ็นเอสายคู่ จะปล่อยสัญญาณเรืองแสงซึ่งมีความเข้มเป็นสัดส่วนกับปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้น วิธีนี้มีข้อดีคือใช้งานง่ายและต้นทุนต่ำ แต่มีข้อจำกัดด้านความจำเพาะ เนื่องจากสารเรืองแสงสามารถจับกับดีเอ็นเอสายคู่ทุกชนิด รวมถึงผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะ (non-specific products

Probe-based assay
เป็นการตรวจวัดโดยใช้โพรบ (probe) ที่ออกแบบให้มีลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะต่อดีเอ็นเอเป้าหมาย และติดฉลากสารเรืองแสงไว้ที่โพรบ ทำให้มีความจำเพาะและความแม่นยำสูง รูปแบบของโพรบที่ใช้สามารถแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม ได้แก่

• Hydrolysis probes
  เช่น TaqMan probe, Molecular Beacons, FRET probes และ Scorpion probes โดยอาศัยการสลายตัวของโพรบระหว่างการยืดสายดีเอ็นเอ ส่งผลให้เกิดสัญญาณเรืองแสง
• Hybridization probes
  เช่น LightCycler probes ซึ่งใช้หลักการเรืองแสงเมื่อโพรบเข้าจับกับดีเอ็นเอเป้าหมายอย่างจำเพาะ

อ้างอิง

https://meded.psu.ac.th/binlaApp/class02/B2_364_221/Molecular_genetic_part2/index7.html
https://www4.fisheries.go.th/local/file_document/20191225105459_1_file.pdf
https://www.slideshare.net/panothai/original-basic-realtimepcr