เกิดอะไรขึ้นบ้างในกระบวนการ Amplification

Amplification หมายถึง กระบวนการเพิ่มจำนวนของดีเอ็นเอ (DNA) ชนิดใดชนิดหนึ่งในหลอดทดลองให้มีปริมาณมากภายในระยะเวลาอันสั้น โดยอาศัยหลักการเดียวกับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในสิ่งมีชีวิต

 อย่างไรก็ตาม การเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอภายในเซลล์ตามกลไกทางชีวภาพตามธรรมชาตินั้นต้องใช้ระยะเวลานานและควบคุมได้ยาก ด้วยเหตุนี้จึงมีการพัฒนาเทคนิคทางชีววิทยาโมเลกุลที่สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ซึ่งเรียกว่า Polymerase Chain Reaction (PCR)

เทคนิค PCR นับเป็นเครื่องมือพื้นฐานที่มีความสำคัญอย่างยิ่งในงานวิจัยทางพันธุศาสตร์ การวินิจฉัยทางการแพทย์ นิติวิทยาศาสตร์ และชีววิทยาระดับโมเลกุลในปัจจุบัน

องค์ประกอบหลักของปฏิกิริยา PCR

การทำปฏิกิริยา PCR ให้ประสบผลสำเร็จจำเป็นต้องมีองค์ประกอบสำคัญดังต่อไปนี้

1. ดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA Template)

ดีเอ็นเอต้นแบบคือดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตที่มีบริเวณหรือยีนเป้าหมายที่ต้องการศึกษา โดยมักได้มาจากการสกัดดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อหรือเซลล์ของสิ่งมีชีวิต ปัจจัยที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพของ PCR ได้แก่

ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ
ความสมบูรณ์ของสายดีเอ็นเอ
ปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบที่เหมาะสม

หากดีเอ็นเอมีสิ่งปนเปื้อนหรือมีปริมาณไม่เหมาะสม อาจส่งผลให้เกิดผลผลิต PCR ที่ต่ำหรือไม่จำเพาะ

2. ไพรเมอร์ (Primer)

ไพรเมอร์คือดีเอ็นเอสายสั้น (oligonucleotide) ที่มีลำดับเบสคู่สม (complementary) กับดีเอ็นเอต้นแบบ ทำหน้าที่เป็นจุดเริ่มต้นให้เอนไซม์ DNA polymerase สังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ ไพรเมอร์จะถูกสังเคราะห์ด้วยเครื่อง DNA oligonucleotide synthesizer และสามารถสั่งซื้อจากบริษัทผู้ให้บริการ โดยราคาขึ้นอยู่กับจำนวนเบส

โดยทั่วไปจะใช้ไพรเมอร์อย่างน้อย 1 คู่ ได้แก่

• Forward primer จับกับดีเอ็นเอต้นแบบในทิศทาง 3’ → 5’ (antisense strand)
• Reverse primer จับกับดีเอ็นเอต้นแบบในทิศทาง 5’ → 3’ (sense strand)

การออกแบบไพรเมอร์ต้องมีความจำเพาะสูง เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิด primer dimer การจับกันเองของไพรเมอร์ (self-complementary) หรือการเกิดโครงสร้าง hairpin loop ซึ่งอาจรบกวนประสิทธิภาพของ PCR

ในปัจจุบันมีการพัฒนาเทคนิค Multiplex PCR ซึ่งเป็นการใช้ไพรเมอร์หลายคู่ในปฏิกิริยาเดียวกัน ทำให้สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอหลายตำแหน่งที่มีขนาดแตกต่างกันได้พร้อมกัน

3. Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs)

dNTPs เป็นสารตั้งต้นสำหรับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิด ได้แก่ dATP, dTTP, dGTP และ dCTP ทำหน้าที่เป็นวัตถุดิบในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่

4. เอนไซม์ DNA Polymerase

DNA polymerase เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่สังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่โดยเติมนิวคลีโอไทด์ต่อจากปลาย 3’ ของไพรเมอร์ เนื่องจากกระบวนการ PCR ต้องใช้อุณหภูมิสูง เอนไซม์ที่ใช้จึงต้องทนความร้อนได้ดี

เอนไซม์ที่นิยมใช้คือ Taq DNA polymerase ซึ่งสกัดจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus ที่อาศัยอยู่ในบ่อน้ำพุร้อน เอนไซม์ชนิดนี้สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงได้โดยไม่เสียสภาพ

เอนไซม์ DNA polymerase ต้องเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20 °C และขณะใช้งานควรเก็บไว้บนน้ำแข็งเพื่อลดการเสื่อมสภาพของเอนไซม์

5. Magnesium Ion (Mg²⁺)

แมกนีเซียมไอออนเป็น co-factor ที่จำเป็นต่อการทำงานของ DNA polymerase และมีบทบาทในการช่วยให้ดีเอ็นเอต้นแบบและสายดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ใหม่จับกันได้อย่างเหมาะสม ความเข้มข้นของ Mg²⁺ มีผลอย่างมากต่อความจำเพาะและปริมาณของผลผลิต PCR

หากมีมากเกินไป อาจทำให้เกิดผลผลิตที่ไม่จำเพาะ
หากมีน้อยเกินไป จะทำให้ได้ผลผลิต PCR ในปริมาณต่ำ

6. Buffer

Buffer ทำหน้าที่รักษาสภาพแวดล้อมและค่า pH ให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase ตลอดกระบวนการ PCR

7. เครื่อง Thermocycler

Thermocycler เป็นเครื่องมือที่ใช้ควบคุมอุณหภูมิในแต่ละขั้นตอนของ PCR โดยสามารถตั้งโปรแกรมการเปลี่ยนอุณหภูมิและระยะเวลาได้อย่างแม่นยำ

ขั้นตอนของปฏิกิริยา PCR

ปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลัก ซึ่งจะทำซ้ำหลายรอบตามที่กำหนด

1. Denaturation

เป็นขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอสายคู่ (double-stranded DNA) ออกเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single-stranded DNA) โดยใช้อุณหภูมิสูงประมาณ 90–95 °C เพื่อทำลายพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบสคู่สม ดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ได้จะทำหน้าที่เป็นต้นแบบในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่

อุณหภูมิและระยะเวลาในขั้นตอนนี้มีผลต่อประสิทธิภาพของ PCR หากอุณหภูมิสูงเกินไปหรือใช้เวลานานเกินไป อาจทำให้ดีเอ็นเอหรือเอนไซม์เสียสภาพได้

2. Annealing

เป็นขั้นตอนการลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วงประมาณ 50–66 °C เพื่อให้ไพรเมอร์เข้าจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยวในตำแหน่งที่เป็นเบสคู่สม อุณหภูมิที่เหมาะสมจะขึ้นอยู่กับค่า melting temperature (Tm) ของไพรเมอร์แต่ละคู่

3. Extension

เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยเอนไซม์ DNA polymerase จะเติมนิวคลีโอไทด์จาก dNTPs ต่อจากไพรเมอร์ในทิศทาง 5’ → 3’ โดย Taq DNA polymerase จะทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิประมาณ 70–72 °C

เมื่อครบทั้ง 3 ขั้นตอน จะถือเป็น 1 รอบของ PCR โดยทั่วไปจะทำประมาณ 30–40 รอบ ส่งผลให้ปริมาณดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นตามหลักการ 2ⁿ (n = จำนวนรอบของ PCR)+

อ้างอิง

อำไพวรรณ จวนสัมฤทธิ์ และคณะ. (2534). ความรู้พื้นฐานเรื่องเวชพันธุศาสตร์ II: Polymerase Chain Reaction.
คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์. Molecular Genetics.
Lucigen. PCR and Amplification Products.